Els terapèutics basats en àcids nucleics han emergit com una de les classes de medicaments innovadors de més ràpid creixement, oferint noves oportunitats de tractament per a malalties que tradicionalment han estat difícils d’abordar utilitzant petites molècules convencionals o productes biològics. Els oligonucleòtids antisentit (ASO), els ARN d’interferència petits (siRNA), els aptàmers, els terapèutics d’ARN missatger (mRNA) i altres modalitats basades en àcids nucleics progressen ràpidament a través del desenvolupament de fàrmacs, impulsant la necessitat de mètodes bioanalítics robustos capaços de caracteritzar amb precisió aquestes molècules complexes (1,2).
En comparació amb les petites molècules tradicionals, els terapèutics d’oligonucleòtids presenten reptes analítics únics. La seva mida molecular relativament gran, l’alta polaritat i la susceptibilitat a la degradació mediada per nucleases compliquen l’extracció i la quantificació de matrius biològiques. A més, sovint generen metabòlits truncats que poden diferir del compost original per un sol nucleòtid, tot i que presenten propietats farmacològiques o toxicològiques diferents. En conseqüència, els mètodes bioanalítics sensibles i selectius són essencials per donar suport als estudis farmacocinètics, toxicocinètics, de biodistribució i de biomarcadors (1–3).
A Kymos, donem suport a la bioanàlisi de terapèutics d’àcids nucleics utilitzant metodologies de biologia molecular i basades en espectrometria de masses, desenvolupant mètodes analítics adequats per a cada propòsit tant per a estudis preclínics com clínics.
Aproximacions bioanalítiques per a terapèutics d’àcids nucleics
L’estratègia analítica depèn tant de la modalitat terapèutica com dels objectius de cada estudi. Com que cap tecnologia pot respondre a totes les preguntes analítiques, sovint es combinen tècniques analítiques complementàries per abordar diferents punts finals bioanalítics. A Kymos, aquestes aproximacions inclouen:
- Quantificació de biomarcadors utilitzant PCR quantitativa en temps real (qPCR) d’alta sensibilitat, amb detecció fins a 1 pg/mL.
- Quantificació d’oligonucleòtids terapèutics utilitzant ELISA d’hibridació, qPCR i LC-MS/MS.
- Quantificació d’ADN, mRNA, siRNA, aptàmers i antagomiRs.
- Anàlisi de l’expressió gènica utilitzant el mètode ΔΔCt.
- Detecció d’ADN o ARN viral i bacterià.
- Estudis de biodistribució per a terapèutics i vacunes basats en ADN i ARN.
- Anàlisi d’ADN humà residual per avaluar l’eficiència de la descel·lularització d’al·loempelt.
Tot i que la qPCR continua sent el mètode d’elecció per a moltes aplicacions de biomarcadors i expressió gènica, la creixent complexitat dels oligonucleòtids terapèutics ha impulsat l’adopció de tecnologies analítiques complementàries que proporcionen una major especificitat molecular i caracterització de metabòlits.
LC-MS/MS: ampliant el conjunt d’eines analítiques
Els avenços recents en la cromatografia líquida acoblada a l’espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS) han ampliat significativament el conjunt d’eines analítiques disponibles per als oligonucleòtids terapèutics (2–4). A diferència dels assajos ELISA d’hibridació, la LC-MS/MS identifica directament els analits segons la seva massa molecular i els patrons de fragmentació característics, permetent una quantificació precisa del compost original juntament amb la discriminació de metabòlits estretament relacionats. A diferència dels mètodes basats en hibridació, la LC-MS/MS proporciona una detecció molecular directa, permetent no només una quantificació precisa sinó també la confirmació estructural de l’analit. Aquest nivell addicional d’especificitat és particularment valuós quan s’analitzen oligonucleòtids químicament modificats o es distingeixen metabòlits estretament relacionats que no es poden diferenciar utilitzant només assajos basats en sondes.
Aquesta capacitat és particularment valuosa perquè els oligonucleòtids terapèutics sovint experimenten degradació mediada per exonucleases, produint metabòlits escurçats com les espècies N−1 que poden contribuir a l’eficàcia o la seguretat. La LC-MS/MS també és adequada per a oligonucleòtids químicament modificats, inclosos els oligonucleòtids de fosforotioat i les molècules conjugades amb lligands, proporcionant una alta especificitat analítica i confiança en la identificació de l’analit (1–4).
Els mètodes LC-MS/MS de Kymos donen suport a l’anàlisi d’oligonucleòtids terapèutics en plasma i homogenats de teixits. La hibridació amb perles magnètiques seqüència-específiques permet una purificació selectiva de la mostra abans de l’anàlisi quantitativa LC-MS/MS en rangs de concentració típicament entre 1 i 1000 ng/mL.
Hibridació amb perles magnètiques: la clau per a una preparació selectiva de mostres
Una preparació eficient de mostres és fonamental per a una bioanàlisi LC-MS/MS exitosa. Les matrius biològiques contenen proteïnes, fosfolípids i àcids nucleics endògens que poden interferir amb la detecció per espectrometria de masses. Per superar aquests reptes, Kymos utilitza la hibridació amb perles magnètiques seqüència-específiques abans de l’anàlisi LC-MS/MS (1,2).
Les partícules magnètiques es funcionalitzen amb sondes d’oligonucleòtids de captura que són complementàries a la seqüència terapèutica d’interès. Les sondes de captura s’immobilitzen a la superfície de la perla magnètica, típicament mitjançant interaccions biotina-estreptavidina, assegurant una unió estable i altament selectiva durant tot el procés d’extracció. Després de la hibridació, un separador magnètic aïlla els complexos perla-objectiu mentre es retira la matriu biològica restant. Les proteïnes, els fosfolípids i altres components de la matriu endògena s’eliminen eficientment durant els passos de rentat posteriors, i una el·lució controlada allibera l’oligonucleòtid purificat per a l’anàlisi LC-MS/MS.
Aquest flux de treball és ràpid, altament selectiu i compatible amb plataformes automatitzades de manipulació de líquids, el que el fa adequat per a estudis d’alt rendiment. En comparació amb els mètodes d’extracció convencionals, la hibridació amb perles magnètiques ofereix diversos avantatges:
- Alta especificitat de seqüència.
- Purificació eficient de matrius biològiques complexes.
- Reducció dels efectes de matriu i la supressió iònica.
- Excel·lent reproductibilitat i baixa contaminació creuada de mostres.
- Compatibilitat amb fluxos de treball automatitzats d’alt rendiment.
- Discriminació precisa de metabòlits estretament relacionats, inclosos els productes de degradació N−1 (1,2,4).
Combinant l’enriquiment selectiu amb la detecció LC-MS/MS altament específica, aquest flux de treball integrat permet una quantificació robusta d’oligonucleòtids terapèutics en matrius biològiques complexes, donant suport als estudis farmacocinètics, de biodistribució i de metabolisme.
Donant suport a la pròxima generació de terapèutics d’àcids nucleics
Els medicaments basats en àcids nucleics continuen evolucionant, i les metodologies bioanalítiques també han d’avançar per abordar la seva creixent complexitat. En lloc de reemplaçar tècniques establertes com la qPCR o l’ELISA d’hibridació, la LC-MS/MS complementa aquestes aproximacions proporcionant una major especificitat molecular i discriminació de metabòlits (2–4).
Combinant l’experiència en biologia molecular amb capacitats avançades d’espectrometria de masses, Kymos ofereix solucions bioanalítiques adaptades a cada modalitat terapèutica i estudi. La integració de tècniques analítiques complementàries permet una caracterització més completa dels oligonucleòtids terapèutics, donant suport als estudis farmacocinètics, de biodistribució i de metabolisme, alhora que proporciona les dades fiables necessàries per accelerar el desenvolupament de la pròxima generació de medicaments basats en àcids nucleics.
Referències
- Rooney M, Ji QC, Leung K, et al. Cromatografia líquida d’hibridació-espectrometria de masses en tàndem: un mètode bioanalític alternatiu per a la quantificació d’oligonucleòtids antisentit en mostres de plasma i teixits. Analytical Chemistry. 2020;92(15):10239-10247.
- Yuan L. Cromatografia líquida d’hibridació-espectrometria de masses per a la bioanàlisi quantitativa d’oligonucleòtids: el pròxim canvi de paradigma. Journal of Chromatography A. 2026;1766:466575.
- Yuan L. Bioanàlisi d’oligonucleòtids. A: Ahuja S, Dong MW, editors. Especificació de substàncies i productes farmacèutics: desenvolupament i validació de mètodes analítics. Elsevier; 2025. p. 209-243.
- Gilar M, Biba M, DeLano M, et al. Bioanàlisi d’oligonucleòtids per LC-MS: efectes dels reactius d’aparellament iònic i avenços recents en estratègies analítiques sense aparellament iònic. Molecules. 2022;27(23):8875.
- Agència Europea de Medicaments. Directriu sobre la validació de mètodes bioanalítics. EMA; 2011.
- Resolve Mass Spectrometry. Bioanàlisi LC-MS per a oligonucleòtids. Disponible a: https://resolvemass.ca/lc-ms-bioanalysis-for-oligonucleotides/ (consultat el juliol de 2026).
