Les thérapies à base d’acides nucléiques sont devenues l’une des classes de médicaments innovants connaissant la croissance la plus rapide, offrant de nouvelles opportunités de traitement pour des maladies traditionnellement difficiles à traiter avec des petites molécules ou des produits biologiques conventionnels. Les oligonucléotides antisens (ASO), les petits ARN interférents (siRNA), les aptamères, les thérapies à ARN messager (mRNA) et d’autres modalités à base d’acides nucléiques progressent rapidement dans le développement de médicaments, ce qui nécessite des méthodes bioanalytiques robustes capables de caractériser avec précision ces molécules complexes (1,2).
Comparés aux petites molécules traditionnelles, les oligonucléotides thérapeutiques présentent des défis analytiques uniques. Leur taille moléculaire relativement importante, leur forte polarité et leur susceptibilité à la dégradation par les nucléases compliquent l’extraction et la quantification à partir de matrices biologiques. De plus, ils génèrent souvent des métabolites tronqués qui peuvent différer du composé parent par un seul nucléotide tout en présentant des propriétés pharmacologiques ou toxicologiques distinctes. Par conséquent, des méthodes bioanalytiques sensibles et sélectives sont essentielles pour soutenir les études pharmacocinétiques, toxicocinétiques, de biodistribution et de biomarqueurs (1–3).
Chez Kymos, nous soutenons la bioanalyse des thérapies à base d’acides nucléiques en utilisant des méthodologies de biologie moléculaire et de spectrométrie de masse, en développant des méthodes analytiques adaptées à l’objectif pour les études précliniques et cliniques.
Approches bioanalytiques pour les thérapies à base d’acides nucléiques
La stratégie analytique dépend à la fois de la modalité thérapeutique et des objectifs de chaque étude. Étant donné qu’aucune technologie unique ne peut répondre à toutes les questions analytiques, des techniques analytiques complémentaires sont souvent combinées pour répondre à différents objectifs bioanalytiques. Chez Kymos, ces approches comprennent :
- Quantification de biomarqueurs à l’aide de la PCR quantitative en temps réel (qPCR) hautement sensible, avec une détection jusqu’à 1 pg/mL.
- Quantification d’oligonucléotides thérapeutiques à l’aide d’ELISA par hybridation, de qPCR et de LC-MS/MS.
- Quantification d’ADN, d’ARNm, de siRNA, d’aptamères et d’antagomiR.
- Analyse de l’expression génique à l’aide de la méthode ΔΔCt.
- Détection d’ADN ou d’ARN viral et bactérien.
- Études de biodistribution pour les thérapies et vaccins à base d’ADN et d’ARN.
- Analyse de l’ADN humain résiduel pour évaluer l’efficacité de la décellularisation des allogreffes.
Bien que la qPCR reste la méthode de choix pour de nombreuses applications de biomarqueurs et d’expression génique, la complexité croissante des oligonucléotides thérapeutiques a conduit à l’adoption de technologies analytiques complémentaires offrant une plus grande spécificité moléculaire et une meilleure caractérisation des métabolites.
LC-MS/MS : élargir la boîte à outils analytique
Les progrès récents de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) ont considérablement élargi la boîte à outils analytique disponible pour les oligonucléotides thérapeutiques (2–4). Contrairement aux dosages ELISA par hybridation, la LC-MS/MS identifie directement les analytes en fonction de leur masse moléculaire et de leurs profils de fragmentation caractéristiques, permettant une quantification précise du composé parent ainsi que la discrimination de métabolites étroitement apparentés. Contrairement aux méthodes basées sur l’hybridation, la LC-MS/MS fournit une détection moléculaire directe, permettant non seulement une quantification précise mais aussi une confirmation structurelle de l’analyte. Ce niveau supplémentaire de spécificité est particulièrement précieux lors de l’analyse d’oligonucléotides chimiquement modifiés ou de la distinction de métabolites étroitement apparentés qui peuvent ne pas être différenciés en utilisant uniquement des dosages basés sur des sondes.
Cette capacité est particulièrement précieuse car les oligonucléotides thérapeutiques subissent fréquemment une dégradation médiée par les exonucléases, produisant des métabolites raccourcis tels que les espèces N−1 qui peuvent contribuer à l’efficacité ou à la sécurité. La LC-MS/MS est également bien adaptée aux oligonucléotides chimiquement modifiés, y compris les oligonucléotides phosphorothioates et les molécules conjuguées à des ligands, offrant une spécificité analytique élevée et une confiance dans l’identification de l’analyte (1–4).
Les méthodes LC-MS/MS chez Kymos soutiennent l’analyse d’oligonucléotides thérapeutiques dans le plasma et les homogénats de tissus. L’hybridation sur billes magnétiques spécifiques de séquence permet une purification sélective de l’échantillon avant l’analyse quantitative par LC-MS/MS sur des gammes de concentration généralement comprises entre 1 et 1 000 ng/mL.
Hybridation sur billes magnétiques : la clé d’une préparation sélective des échantillons
Une préparation efficace des échantillons est essentielle pour une bioanalyse LC-MS/MS réussie. Les matrices biologiques contiennent des protéines, des phospholipides et des acides nucléiques endogènes qui peuvent interférer avec la détection par spectrométrie de masse. Pour surmonter ces défis, Kymos utilise l’hybridation sur billes magnétiques spécifiques de séquence avant l’analyse LC-MS/MS (1,2).
Les particules magnétiques sont fonctionnalisées avec des sondes oligonucléotidiques de capture complémentaires à la séquence thérapeutique d’intérêt. Les sondes de capture sont immobilisées sur la surface des billes magnétiques, généralement par des interactions biotine-streptavidine, assurant une liaison stable et hautement sélective tout au long du processus d’extraction. Après l’hybridation, un séparateur magnétique isole les complexes bille-cible tandis que la matrice biologique restante est éliminée. Les protéines, les phospholipides et autres composants matriciels endogènes sont efficacement éliminés lors des étapes de lavage ultérieures, et une élution contrôlée libère l’oligonucléotide purifié pour l’analyse LC-MS/MS.
Ce flux de travail est rapide, hautement sélectif et compatible avec les plateformes de manipulation de liquides automatisées, ce qui le rend adapté aux études à haut débit. Comparée aux méthodes d’extraction conventionnelles, l’hybridation sur billes magnétiques offre plusieurs avantages :
- Spécificité de séquence élevée.
- Purification efficace à partir de matrices biologiques complexes.
- Effets matriciels et suppression d’ions réduits.
- Excellente reproductibilité et faible report d’échantillon.
- Compatibilité avec les flux de travail automatisés à haut débit.
- Discrimination précise de métabolites étroitement apparentés, y compris les produits de dégradation N−1 (1,2,4).
En combinant un enrichissement sélectif avec une détection LC-MS/MS hautement spécifique, ce flux de travail intégré permet une quantification robuste des oligonucléotides thérapeutiques dans des matrices biologiques complexes, soutenant les études pharmacocinétiques, de biodistribution et de métabolisme.
Soutenir la prochaine génération de thérapies à base d’acides nucléiques
Les médicaments à base d’acides nucléiques continuent d’évoluer, et les méthodologies bioanalytiques doivent également progresser pour répondre à leur complexité croissante. Plutôt que de remplacer les techniques établies telles que la qPCR ou l’ELISA par hybridation, la LC-MS/MS complète ces approches en fournissant une spécificité moléculaire améliorée et une discrimination des métabolites (2–4).
En combinant une expertise en biologie moléculaire avec des capacités avancées de spectrométrie de masse, Kymos fournit des solutions bioanalytiques adaptées à chaque modalité thérapeutique et étude. L’intégration de techniques analytiques complémentaires permet une caractérisation plus complète des oligonucléotides thérapeutiques, soutenant les études pharmacocinétiques, de biodistribution et de métabolisme tout en fournissant les données fiables nécessaires pour accélérer le développement de la prochaine génération de médicaments à base d’acides nucléiques.
Références
- Rooney M, Ji QC, Leung K, et al. Hybridization Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry: An Alternative Bioanalytical Method for Antisense Oligonucleotide Quantitation in Plasma and Tissue Samples. Analytical Chemistry. 2020;92(15):10239-10247.
- Yuan L. Hybridization Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for Quantitative Bioanalysis of Oligonucleotides: The Upcoming Paradigm Shift. Journal of Chromatography A. 2026;1766:466575.
- Yuan L. Bioanalysis of Oligonucleotides. In: Ahuja S, Dong MW, editors. Specification of Drug Substances and Products: Development and Validation of Analytical Methods. Elsevier; 2025. p. 209-243.
- Gilar M, Biba M, DeLano M, et al. Bioanalysis of Oligonucleotide by LC-MS: Effects of Ion Pairing Reagents and Recent Advances in Ion-Pairing-Free Analytical Strategies. Molecules. 2022;27(23):8875.
- European Medicines Agency. Guideline on Bioanalytical Method Validation. EMA; 2011.
- Resolve Mass Spectrometry. LC-MS Bioanalysis for Oligonucleotides. Available at: https://resolvemass.ca/lc-ms-bioanalysis-for-oligonucleotides/ (accessed July 2026).
