핵산 기반 치료제는 기존의 소분자나 생물의약품으로는 접근이 어려웠던 질환에 새로운 치료 기회를 제공하며, 혁신 의약품 중 가장 빠르게 성장하는 계열 중 하나로 부상했습니다. 항센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 소간섭 RNA(siRNA), 압타머, 메신저 RNA(mRNA) 치료제 및 기타 핵산 기반 모달리티는 신약 개발 과정에서 빠르게 진전되고 있으며, 이러한 복잡한 분자를 정확하게 특성화할 수 있는 견고한 생물분석 방법에 대한 수요를 견인하고 있습니다(1,2).
전통적인 소분자와 비교할 때, 올리고뉴클레오타이드 치료제는 고유한 분석적 과제를 제시합니다. 비교적 큰 분자 크기, 높은 극성, 뉴클레아제 매개 분해에 대한 취약성은 생체 매트릭스에서의 추출 및 정량을 복잡하게 만듭니다. 또한 이들은 종종 절단된 대사체를 생성하는데, 이는 단 하나의 뉴클레오타이드 차이만으로도 모화합물과 구분되면서 서로 다른 약리학적 또는 독성학적 특성을 보일 수 있습니다. 따라서 약동학, 독성약동학, 생체분포 및 바이오마커 연구를 지원하기 위해서는 민감도와 선택성이 높은 생물분석 방법이 필수적입니다(1–3).
Kymos는 분자생물학 및 질량분석 기반 방법론을 활용해 핵산 치료제의 생물분석을 지원하며, 전임상 및 임상 연구 모두에 적합한 목적 적합(fit-for-purpose) 분석법을 개발합니다.
핵산 치료제를 위한 생물분석 접근법
분석 전략은 치료 모달리티와 각 연구의 목적 모두에 따라 달라집니다. 단일 기술로 모든 분석 질문에 답할 수는 없기 때문에, 서로 다른 생물분석 엔드포인트를 다루기 위해 상보적인 분석 기법을 함께 사용하는 경우가 많습니다. Kymos의 접근법에는 다음이 포함됩니다:
- 검출 한계 1 pg/mL까지 가능한 고감도 실시간 정량 PCR(qPCR)을 이용한 바이오마커 정량.
- 하이브리다이제이션 ELISA, qPCR 및 LC-MS/MS를 이용한 치료용 올리고뉴클레오타이드 정량.
- DNA, mRNA, siRNA, 압타머 및 안타고미R 정량.
- ΔΔCt 방법을 이용한 유전자 발현 분석.
- 바이러스 및 세균 DNA 또는 RNA 검출.
- DNA 및 RNA 기반 치료제와 백신의 생체분포 연구.
- 동종이식편 탈세포화 효율 평가를 위한 잔류 인간 DNA 분석.
qPCR은 많은 바이오마커 및 유전자 발현 응용에서 여전히 선택되는 방법이지만, 치료용 올리고뉴클레오타이드의 복잡성이 증가함에 따라 더 높은 분자 특이성과 대사체 특성화를 제공하는 상보적 분석 기술의 도입이 촉진되었습니다.
LC-MS/MS: 분석 툴박스 확장
최근 액체 크로마토그래피와 탠덤 질량분석(LC-MS/MS)의 결합 기술 발전은 치료용 올리고뉴클레오타이드에 활용 가능한 분석 툴박스를 크게 확장했습니다(2–4). 하이브리다이제이션 ELISA 분석과 달리, LC-MS/MS는 분자량과 특징적인 분해 패턴에 따라 분석물을 직접 식별하여 모화합물을 정확히 정량하는 동시에 매우 유사한 대사체를 구별할 수 있습니다. 하이브리다이제이션 기반 방법과 비교해 LC-MS/MS는 분자를 직접 검출하므로, 정확한 정량뿐 아니라 분석물의 구조적 확인도 가능합니다. 이러한 추가적인 특이성은 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드를 분석하거나, 프로브 기반 분석만으로는 구분하기 어려운 매우 유사한 대사체를 식별할 때 특히 유용합니다.
이러한 역량은 치료용 올리고뉴클레오타이드가 엑소뉴클레아제 매개 분해를 자주 겪어 효능이나 안전성에 기여할 수 있는 N−1 종과 같은 단축 대사체를 생성하기 때문에 특히 중요합니다. LC-MS/MS는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 및 리간드 결합 분자 등 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드에도 매우 적합하며, 높은 분석 특이성과 분석물 식별에 대한 신뢰도를 제공합니다(1–4).
Kymos의 LC-MS/MS 방법은 혈장 및 조직 균질액에서 치료용 올리고뉴클레오타이드 분석을 지원합니다. 서열 특이적 자기 비드 하이브리다이제이션을 통해 정량 LC-MS/MS 분석 전에 선택적으로 시료를 정제할 수 있으며, 일반적으로 1~1000 ng/mL 범위의 농도에서 분석이 가능합니다.
자기 비드 하이브리다이제이션: 선택적 시료 전처리의 핵심
효율적인 시료 전처리는 성공적인 LC-MS/MS 생물분석에 매우 중요합니다. 생체 매트릭스에는 질량분석 검출을 방해할 수 있는 단백질, 인지질 및 내인성 핵산이 포함되어 있습니다. 이러한 과제를 극복하기 위해 Kymos는 LC-MS/MS 분석 전에 서열 특이적 자기 비드 하이브리다이제이션을 적용합니다(1,2).
자기 입자는 관심 치료 서열에 상보적인 포획 올리고뉴클레오타이드 프로브로 기능화됩니다. 포획 프로브는 일반적으로 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 자기 비드 표면에 고정화되어, 추출 과정 전반에서 안정적이고 매우 선택적인 결합을 보장합니다. 하이브리다이제이션 후에는 자기 분리기가 비드-타깃 복합체를 분리하고, 나머지 생체 매트릭스는 제거됩니다. 이후 세척 단계에서 단백질, 인지질 및 기타 내인성 매트릭스 성분이 효율적으로 제거되며, 제어된 용출을 통해 정제된 올리고뉴클레오타이드가 방출되어 LC-MS/MS 분석에 사용됩니다.
이 워크플로는 빠르고 선택성이 높으며 자동화 액체 핸들링 플랫폼과도 호환되어 고처리량 연구에 적합합니다. 기존 추출 방법과 비교할 때, 자기 비드 하이브리다이제이션은 다음과 같은 여러 장점을 제공합니다:
- 높은 서열 특이성.
- 복잡한 생체 매트릭스로부터의 효율적인 정제.
- 매트릭스 효과 및 이온 억제 감소.
- 우수한 재현성과 낮은 시료 캐리오버.
- 자동화된 고처리량 워크플로와의 호환성.
- N−1 분해 산물을 포함한 매우 유사한 대사체의 정확한 구별(1,2,4).
선택적 농축과 고특이적 LC-MS/MS 검출을 결합함으로써, 이 통합 워크플로는 까다로운 생체 매트릭스에서 치료용 올리고뉴클레오타이드를 견고하게 정량할 수 있게 하며, 약동학, 생체분포 및 대사 연구를 지원합니다.
차세대 핵산 치료제 개발 지원
핵산 기반 의약품은 계속 진화하고 있으며, 생물분석 방법론 역시 증가하는 복잡성에 대응하기 위해 발전해야 합니다. LC-MS/MS는 qPCR이나 하이브리다이제이션 ELISA와 같은 확립된 기법을 대체하기보다는, 향상된 분자 특이성과 대사체 구별 능력을 제공함으로써 이러한 접근법을 보완합니다(2–4).
Kymos는 분자생물학 전문성과 첨단 질량분석 역량을 결합해 각 치료 모달리티와 연구에 맞춘 생물분석 솔루션을 제공합니다. 상보적 분석 기법을 통합하면 치료용 올리고뉴클레오타이드에 대한 보다 완전한 특성화가 가능해져 약동학, 생체분포 및 대사 연구를 지원하는 동시에, 차세대 핵산 기반 의약품 개발을 가속화하는 데 필요한 신뢰할 수 있는 데이터를 제공합니다.
참고문헌
- Rooney M, Ji QC, Leung K, et al. 하이브리다이제이션 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석: 혈장 및 조직 시료에서 항센스 올리고뉴클레오타이드 정량을 위한 대안적 생물분석 방법. Analytical Chemistry. 2020;92(15):10239-10247.
- Yuan L. 올리고뉴클레오타이드의 정량 생물분석을 위한 하이브리다이제이션 액체 크로마토그래피-질량분석: 다가오는 패러다임 전환. Journal of Chromatography A. 2026;1766:466575.
- Yuan L. 올리고뉴클레오타이드의 생물분석. In: Ahuja S, Dong MW, editors. 의약품 원료 및 제품의 규격: 분석법 개발 및 밸리데이션. Elsevier; 2025. p. 209-243.
- Gilar M, Biba M, DeLano M, et al. LC-MS를 이용한 올리고뉴클레오타이드 생물분석: 이온 페어링 시약의 영향 및 최근의 무(無) 이온-페어링 분석 전략 발전. Molecules. 2022;27(23):8875.
- European Medicines Agency. 생물분석 방법 밸리데이션 가이드라인. EMA; 2011.
- Resolve Mass Spectrometry. 올리고뉴클레오타이드를 위한 LC-MS 생물분석. Available at: https://resolvemass.ca/lc-ms-bioanalysis-for-oligonucleotides/ (accessed July 2026).
