核酸药物已成为增长最快的创新药物类别之一，为传统小分子或生物制品难以解决的疾病提供了新的治疗机会。反义寡核苷酸 (ASO)、小干扰 RNA (siRNA)、适配体、信使 RNA (mRNA) 疗法和其他核酸类药物形式正在药物开发中迅速推进，这推动了对能够准确表征这些复杂分子的稳健生物分析方法的需求 (1,2)。
与传统小分子相比，寡核苷酸疗法带来了独特的分析挑战。它们相对较大的分子量、高极性以及易受核酸酶介导的降解影响，使得从生物基质中进行提取和定量变得复杂。此外，它们通常会产生截短的代谢物，这些代谢物可能仅与母体化合物相差一个核苷酸，但却表现出截然不同的药理学或毒理学特性。因此，灵敏且具有选择性的生物分析方法对于支持药代动力学、毒代动力学、生物分布和生物标志物研究至关重要 (1–3)。
在 Kymos，我们利用分子生物学和基于质谱的方法支持核酸疗法的生物分析，为临床前和临床研究开发符合预期用途的分析方法。
核酸疗法的生物分析方法
分析策略取决于治疗形式和每项研究的目标。由于没有任何单一技术可以回答所有分析问题，因此通常结合互补的分析技术来解决不同的生物分析终点。在 Kymos，这些方法包括：
- 使用高灵敏度实时荧光定量 PCR (qPCR) 进行生物标志物定量，检测限低至 1 pg/mL。
- 使用杂交 ELISA、qPCR 和 LC-MS/MS 对治疗性寡核苷酸进行定量。
- DNA、mRNA、siRNA、适配体和 antagomiRs 的定量。
- 使用 ΔΔCt 方法进行基因表达分析。
- 病毒和细菌 DNA 或 RNA 的检测。
- 基于 DNA 和 RNA 的疗法及疫苗的生物分布研究。
- 残留人类 DNA 分析，以评估同种异体移植物脱细胞效率。
虽然 qPCR 仍然是许多生物标志物和基因表达应用的首选方法，但治疗性寡核苷酸日益增加的复杂性推动了互补分析技术的采用，这些技术可提供更高的分子特异性和代谢物表征能力。
LC-MS/MS：扩展分析工具箱
液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 的最新进展显著扩展了治疗性寡核苷酸可用的分析工具箱 (2–4)。与杂交 ELISA 分析不同，LC-MS/MS 根据分析物的分子质量和特征碎片图谱直接识别分析物，从而能够对母体化合物进行准确测定，并区分密切相关的代谢物。与基于杂交的方法相比，LC-MS/MS 提供直接的分子检测，不仅能实现准确测定，还能对分析物进行结构确认。这种更高水平的特异性在分析化学修饰的寡核苷酸或区分仅靠基于探针的分析无法区分的密切相关代谢物时尤为宝贵。
这种能力特别有用，因为治疗性寡核苷酸经常发生外切核酸酶介导的降解，产生缩短的代谢物（如 N−1 物种），这些代谢物可能会影响疗效或安全性。LC-MS/MS 也非常适合化学修饰的寡核苷酸，包括硫代磷酸酯寡核苷酸和配体结合分子，为分析物识别提供高度的分析特异性和可信度 (1–4)。
Kymos 的 LC-MS/MS 方法支持血浆和组织匀浆中治疗性寡核苷酸的分析。序列特异性磁珠杂交可在定量 LC-MS/MS 分析之前进行选择性样品纯化，浓度范围通常在 1 至 1000 ng/mL 之间。
磁珠杂交：选择性样品制备的关键
高效的样品制备对于成功的 LC-MS/MS 生物分析至关重要。生物基质含有蛋白质、磷脂和内源性核酸，这些物质会干扰质谱检测。为了克服这些挑战，Kymos 在 LC-MS/MS 分析之前采用序列特异性磁珠杂交 (1,2)。
磁性颗粒经过功能化处理，带有与目标治疗序列互补的捕获寡核苷酸探针。捕获探针通常通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在磁珠表面，确保在整个提取过程中实现稳定且高度选择性的结合。杂交后，磁分离器分离出磁珠-靶标复合物，同时去除剩余的生物基质。蛋白质、磷脂和其他内源性基质成分在随后的洗涤步骤中被有效消除，受控洗脱释放出纯化的寡核苷酸用于 LC-MS/MS 分析。
该工作流程快速、高度选择性且与自动化液体处理平台兼容，使其适用于高通量研究。与传统的提取方法相比，磁珠杂交具有以下优势：
- 高序列特异性。
- 从复杂生物基质中高效纯化。
- 减少基质效应和离子抑制。
- 出色的重复性和低样品残留。
- 与自动化高通量工作流程兼容。
- 准确区分密切相关的代谢物，包括 N−1 降解产物 (1,2,4)。
通过将选择性富集与高度特异性的 LC-MS/MS 检测相结合，这一集成工作流程能够对具有挑战性的生物基质中的治疗性寡核苷酸进行稳健的定量，从而支持药代动力学、生物分布和代谢研究。
支持下一代核酸疗法
核酸类药物不断发展，生物分析方法也必须进步以应对其日益增加的复杂性。LC-MS/MS 并非取代 qPCR 或杂交 ELISA 等成熟技术，而是通过提供增强的分子特异性和代谢物区分能力来补充这些方法 (2–4)。
Kymos 将分子生物学专业知识与先进的质谱分析能力相结合，提供适应各种治疗形式和研究的生物分析解决方案。整合互补的分析技术可以更完整地表征治疗性寡核苷酸，支持药代动力学、生物分布和代谢研究，同时提供加速下一代核酸类药物开发所需的可靠数据。
参考文献
- Rooney M, Ji QC, Leung K, et al. 杂交液相色谱-串联质谱法：血浆和组织样品中反义寡核苷酸定量的替代生物分析方法。 分析化学。2020;92(15):10239-10247。
- Yuan L. 用于寡核苷酸定量生物分析的杂交液相色谱-质谱法：即将到来的范式转变。 色谱杂志 A。2026;1766:466575。
- Yuan L. 寡核苷酸的生物分析。载于：Ahuja S, Dong MW, 编辑。 原料药和制剂的规格：分析方法的开发与验证。 Elsevier; 2025. 第 209-243 页。
- Gilar M, Biba M, DeLano M, et al. 利用 LC-MS 进行寡核苷酸生物分析：离子对试剂的影响及无离子对分析策略的最新进展。 分子。2022;27(23):8875。
- 欧洲药品管理局。 生物分析方法验证指南。 EMA; 2011。
- Resolve Mass Spectrometry. 寡核苷酸的 LC-MS 生物分析。 详见：https://resolvemass.ca/lc-ms-bioanalysis-for-oligonucleotides/ (访问日期：2026 年 7 月)。
