El desenvolupament i la validació d’un assaig específic del procés per a la determinació de proteïnes de la cèl·lula hoste (HCP) en proteïnes recombinants terapèutiques ha de seguir les especificacions que figuren a la monografia 2.6.34 de la Farmacopea Europea amb un enfocament pas a pas:
1. Producció dels antígens HCP
Aquesta fase la duu a terme el client en una simulació del procés de fabricació de la substància activa utilitzant una línia cel·lular nul·la. Aquesta simulació de producció ha d’imitar el pitjor dels casos pel que fa a la generació d’HCP. S’han d’utilitzar els mètodes analítics actuals per a la substància activa per assegurar que no hi hagi traces de la substància activa. S’ha de dur a terme una purificació mínima (filtració, concentració) per assegurar que no es perdi cap component de l’HCP durant aquest procés.
2. Caracterització dels antígens HCP
L’antigen contra les proteïnes HCP obtingut en la producció simulada s’analitza mitjançant SDS-PAGE i/o electroforesi 2D utilitzant un mètode de tinció sensible (blau de Coomassie o plata) i els resultats obtinguts s’han de comparar amb els resultats obtinguts a partir d’una producció estàndard de la substància activa. Es recomana tenir mostres amb la mínima purificació possible i altres que hagin seguit el procés estàndard posterior.
3. Producció de reactiu d’anticossos policlonals
Les proteïnes antigèniques HCP obtingudes en la producció simulada s’administren a animals (normalment rabins) per induir la resposta immunitària en aquests animals amb l’objectiu d’obtenir sèrums amb un títol elevat d’anticossos contra els antígens HCP. Un cop el títol dels anticossos sèrics mesurats amb una prova ELISA sigui prou alt, cada sèrum s’ha de caracteritzar mitjançant Western Blot i tots els sèrums s’han d’agrupar per obtenir la màxima cobertura de l’HCP en l’assaig ELISA.
4. Purificació i caracterització final del reactiu d’anticossos policlonals
Els sèrums agrupats s’han de purificar addicionalment mitjançant cromatografia de proteïna A o G i caracteritzar-se mitjançant SDS-PAGE, titració i Western Blot.
5. Desenvolupament d’un assaig ELISA quantitatiu per a la determinació d’HCP
S’hauria de desenvolupar un ELISA quantitatiu tenint en compte els següents aspectes:
- Triar el format ELISA més adequat: directe, sandvitx, competitiu, etc.
- Etiquetatge de reactius.
- Optimització de les condicions d’assaig.
- Caracterització de l’assaig: sensibilitat, especificitat, LLOQ, rang, dilució mínima, etc.
- Definició de la prova d’idoneïtat.
6. Validació d’un assaig ELISA quantitatiu per a la determinació d’HCP
Un cop desenvolupat el mètode ELISA, s’ha de dur a terme una validació del mètode avaluant els paràmetres següents:
- Especificitat
- Rang/corba de calibratge
- Precisió i precisió
- Límit de detecció i límit de quantificació
- Estabilitat
- Robustesa
- Linealitat de dilució
7. Anàlisi de mostres
Arribat a aquest punt, el mètode analític es pot utilitzar per a cada lot de fabricació com a mètode de control de qualitat per a l’alliberament. Cada anàlisi ha d’incloure la prova d’idoneïtat establerta en la fase de desenvolupament d’ELISA i realitzada en un laboratori GMP per al propòsit esmentat anteriorment.
