El desarrollo y validación de un ensayo específico de proceso para la determinación de proteínas de células huésped (HCP) en proteínas recombinantes terapéuticas debe seguir las especificaciones contenidas en la monografía 2.6.34 de la Farmacopea Europea en un enfoque paso a paso:
1. Producción de los antígenos HCP
Esta fase la lleva a cabo el cliente en una simulación del proceso de fabricación de la sustancia activa utilizando una línea celular nula. Esta simulación de producción debe simular el peor escenario posible en cuanto a la generación de HCP. Se deben emplear los métodos analíticos actuales para la sustancia activa a fin de garantizar la ausencia de trazas de la misma. Se debe realizar una purificación mínima (filtración, concentración) para garantizar que no se pierda ningún componente del HCP durante este proceso.
2. Caracterización de los antígenos HCP
El antígeno contra las proteínas HCP obtenido en la producción simulada se analiza mediante SDS-PAGE y/o electroforesis 2D utilizando un método de tinción sensible (azul de Coomassie o plata). Los resultados obtenidos deben compararse con los obtenidos en una producción estándar de la sustancia activa. Se recomienda contar con muestras con la mínima purificación posible y otras que hayan seguido el proceso estándar posterior.
3. Producción de reactivo de anticuerpo policlonal
Las proteínas antigénicas HCP obtenidas en la producción simulada se administran a animales (generalmente rabinos) para inducir la respuesta inmunitaria en ellos con el objetivo de obtener sueros con un alto título de anticuerpos contra los antígenos HCP. Una vez que el título de anticuerpos séricos medido mediante una prueba ELISA es suficientemente alto, cada suero debe caracterizarse mediante Western Blot y todos los sueros deben agruparse para obtener la máxima cobertura del HCP en el ensayo ELISA.
4. Purificación y caracterización final del reactivo de anticuerpo policlonal
Los sueros agrupados deben purificarse aún más mediante cromatografía de proteína A o G y caracterizarse mediante SDS-PAGE, titulación y Western Blot.
5. Desarrollo de un ensayo ELISA cuantitativo para la determinación de HCP
Se debe desarrollar una prueba ELISA cuantitativa considerando los siguientes temas:
- Elección del formato ELISA más adecuado: Directo, sándwich, competitivo, etc.
- Etiquetado de reactivos.
- Optimización de las condiciones de ensayo.
- Caracterización del ensayo: Sensibilidad, especificidad, LLOQ, rango, dilución mínima, etc.
- Definición de la prueba de idoneidad.
6. Validación de un ensayo ELISA cuantitativo para la determinación de HCP
Una vez desarrollado el método ELISA, se debe realizar una validación del método evaluando los siguientes parámetros:
- Especificidad
- Rango/curva de calibración
- Exactitud y precisión
- Límite de detección y límite de cuantificación
- Estabilidad
- Robustez
- Linealidad de dilución
7. Análisis de muestras
Una vez alcanzado este punto, el método analítico puede utilizarse para cada lote de fabricación como método de control de calidad para la liberación. Cada análisis debe incluir la prueba de idoneidad establecida en la etapa de desarrollo de ELISA, realizada en un laboratorio con certificación GMP para dicho fin.
